2.1. Misel Üretiminin Önemi ve Gelişmesi
Daha önce de belirttiğimiz gibi mantarlar çiçeksiz bitkilerdir. Dolayısıyla tohumları yoktur. Üretimleri miselleri sayesinde gerçekleştirilir. Mantar yetiştiriciliğinde, değişik maddeler üzerine sardırılarak geliştirilen sekonder miseller kullanılır.
Bu biçimde hazırlanmış misellere spawn veya tohumluk misel adı verilmektedir. Zira tohumluk, tohumdan farklı bir kavram olup üretimde kullanılan generatif veya vegetatif bitki parçalarını kapsar. Böylece tohumluk misel çoğaltma amacıyla hazırlanan ve üretimde kullanılacak olan, hububat daneleri veya bazı organik maddelere sardırılmış sekonder miselleri ifade etmektedir.
Mantarın tanınmasının ve değerlendirilmesinin hayli eski olmasına karşın; mantar miseli üretimi, ancak Mantarın özel koşullarda yetiştirilmeye başlamasından sonra gerçekleşebilmiştir. İlk aşamada mantar yıkama suyunun gübre üzerine serpilmesi ve mantar oluşturması ile yetiştirilmiştir. Kuşkusuz bu uygulamanın anlamı bilinmeden yapıldığı bir gerçektir. 19. Yüzyılınn ikinci yarısından itibaren mantar sporlarnın çimlendirilmesi yolluyla misel elde edilmesi ve bu misellerin üretimde kullanılması gerçekleşmiştir. 1894 yılında Paris';te Pasteur Enstitüsünde ilk kez steril koşullarda tohumluk mantar miseli üretilmiş, bunu A.B.D'de doku kültürü yöntemleri ile tohumluk misel elde edilmesi izlemiştir. Doku kültürü ile misel üretilmesinde, sterilize edilen ahir gübresi üzerine mantar dokusu parçalari bulaştirilmiş, parçalardaki miseller ahir gübresi içinde geliştikten sonra normal aşilamada kullanilmiştir.
Tohumluk misel üretiminde son aşama misellerin hububat daneleri üzerine sardirilmadi olmuştur. Ilk kez 1931 yilinda Amreikali Sinden, mantar misellerini bugddday ve çavdar tohumlari üzerine sardirarak geliştirmiştir. Bu biçimde hazirlanan tohumluk miselin en önemli iki yararli yani, aşilamada kolaylik sagliyarak el emegini azaltmasi ve ayrica misellerin kompostun her yanina eşit miktarda yayilmasi olnak vermesidir. O nedenle hububat danelerine sardirilmiş misel günümüzde dünyanin her yaninda yaygin olarak kullanilan tohumluk misel haline gelmiştir.
2.2.Misellerin Elde Edilmesi, Çogaltilmasi ve Tohumluk Miselin Hazirlanmasi
Tohumluk miselin temizligi ve kalitesi mantar yetiştiriciligi açisindan büyük öneme sahiptir. Zira kültürün gelecegi, kullanilan tohumluk misele baglidir. Miselin yalnizca steril koşullarda hazirlanmasi ve temiz olmasi yeterli bir özellik degildir. Tohumluk misel ayni zamanda çeşitin kendine özgü özelliklerini de bünyesinde yani genotipinde taşimalidir.
Temizligin saglanmasi için, misel üretimi sirasinda steril koşullarin bulunmasi ve korunmasi gerekir. Kuru ortamda yabanci ve zararli organizmalarin gelişmesinin azalacagi unutulmamalidir. Bu nedenle laboratuvar zaman zaman steril hava ile havalandirilmali ve nemden oldugunca kaçinilmalidir. Nem arttikça mikroorganizma üreme şansi artar. Genelde haftada bir defa, havada ve çevredeki mikroorganizma sayisi ve çeşidi kontrol edilmelidir. Bunun için petri kutusunda steril agar ortami hazirlanmali ve kutu misel aşilama ünitesinde açilmali, 20 dakika bekletip, kapatilmali, sonra inkubasyon dolabinda 24-25°C'de gelişmeye birakilmalidir. Herhangi bir organizma üremesi söz konusu olmazsa, oda havasi temizdir. Olursa neyin üredigi ve ne miktar üredigi saptanip, ona göre ilaçlama ve sterilizasyon gerçekleştirilmelidir. Ayrica laboratuvarda çalişan personelin beden ve giysi temizligine özen gösterilmelidir. Çalişmaya başlamadan önce yikanmali ve temiz elbiseler giyilmelidir. Özellikle kültür ve kompost yapimi bölümlerinde çalişanlar veya o bölümleri gezenler hiçbir şekilde misel laboratuvarina sokulmamalidirlar.
Tohumluk misel hazirlanmasi üç ana bölümü kapsamaktadir. Bunlardan birincisi anaç mantarlarin seçimi ve sporlarin elde edilmesi, ikinci ana kültürlerin hazirlanmasi, üçüncüsü de ana kültürler yardimiyla misellerin hububat daneleri veya diger materyaller üzerine sardirilarak tohumluk misellerin elde edilmesidir.
2.2.1.Anaç Mantarin Seçimi ve Sporlarin Elde Edilmesi
Anaç Mantarin seçimi, üretimi yapilacak çeşitin genç ve saglikli kültürlerinin ilk dalgalarindan yapilmalidir. Seçilen mantarlar çeşitin tipik özelliklerini göstermelidir. Bu amaç için gelişmekte olan mantarlar kontrol altina alinir. Hastaliksiz, şapkali geniş ve geç açilan, kisa sapli, kalin meyve etine sahip mantarlar işaretlenir. Seçilen mantarlarin hasi şapkanin saptan ayrilacagina yakin bir zamanda yapilmalidir. Şapkanin tam büyüklügünü aldigi anda seçilen 2-5 adet mantar koparilip laboratuvara getirilir. Önce topraklari temizlenen mantarlarin, daha sonra saplari 1 cm uzunluk kalacak şekilde kesilir. Böylece hem şapka kismi daha dengeli bir yapi kazanir, hem de transpirasyon alani azaltilir. Mantarlarin tüm diş yüzeyleri bir alkollü pamuk yardimiyla silinir ve hizla alevden geçirilerek temizlenir. Diş yüzeylerin dezenfeksiyonu için kullanilan diger yöntemlerde vardir. Mantarlarin 5-10 dakika kadar %1'lik potasyum permanganat eriğinde tutulması veya % 70'lik alkole daldırıldıktan sonra alkol tümüyle yanıncaya kadar alevde tutulması bulara ait iki örnektir.
Dezenfekte edilerek hazırlanan mantarlar daha sonra temiz bir beyaz karton veya temiz bir beyaz karton veya temiz bir cam üzerine, sap ve lameller aşağıda gelecek şekilde yerleştirilir. Hava akımını engellemek ve aseptik koşulları sürdürmek amacıyla üzeri temiz bir cam fanusla kapatılır. Normal oda sıcaklığında birkaç gün sonra şapka kendiliğinden açılır ve lameller görülür. Lamellerin üzerinde oluşan olgun sporlar cam veya karton üzerine dökülmeye başlar. 18-19°C'de bırakılan mantarlar oldukça bol spor bırakmaktadır. karton veya cam üzerinde siyah kahverengi bir iz meydana getiren sporlar bir suluboya fırçası yardımıyla toplanıp steril cam kaplara konur ve kapların ağzı kapatılır. Elde edilen sporlar taze olarak kullanılabileceği gibi uzun süre saklandıktan sonra da çimlendirilebilirler. Kuru ve serin bir yerde mantar Sporlarının altı ay canlı kalabildiği bildirilmektedir. Sporlar soğukta muhafaza edildiğinde bu süre birkaç yıla kadar çıkabilir. Mantar Sporlarını 5-8°C'lerde 4 ay, 3yıl ve 6 yıl boyunca saklanabilir ve ürün alınabilmektedir. Sporların çimlenmeye almadan önce virüslere karşı savaş açısından sıcaklığa maruz bırakılmalarında yarar vardır. Bu amaçla kapalı petri kapları içine dökülen sporlar bir saat süreyle 70°C'de tutulurlar. Bu süre sonunda normal olarak virüsler inaktive edilmişlerdir. Ancak emin olmak için kontrol testi yapilabilir. Bu amaçla sporlar halinde bugday agar ortami petri kaplarina ekilir ve kaplarin bir kismi 20°C'de diğer bir kısmı da 30°C'de bulunan çimlendirme kaplarına yerleştirilir. Sporlarda virüs yoksa, bütün kaplarda çimlenme ve misel gelişimi aynıdır, fakat 20°C'de biraz daha hızlıdır. Eğer virüs varsa 30°C'de virüs bastırıldığından gelişme daha çabuk, buna karşılık 20° C'de daha yavaştir. Almanya'da Hamburg volksdof'daki Max Planck Enstitüsünde virüs testleri bu yöntemle yapılmaktadır.
2.2.2. Sporların Çimlendirilmesi ve Ana Kültürün Hazırlanması
Sporların çimlendirilmesi ve misel elde edilmesi özel besin ortamları üzerinde ve steril koşullarda yapılır. Besin ortamının katılığını sağlamak için agar kullanılır. Besin kaynağı olarak da şeker ,pepton veya diğer organik maddelerden yararlanılır. Bazı mantarlarınsporları kolay çimlendiği halde diğer bazılarınınki sorun yaratır. Bazı durumlarda ortama o Mantarın misellerinden veya bazı kimyasal maddelerden katmak gerekebilir. Örneğin bal ve kloroformun Agaricus macroporus'ta çimlenmeyi 8 gün kısalttığını bildirmektedir.
Ortamlara Sporların ekimi yine steril bir yerde yapılır. Ekimi için şişelerin ağzı açılır ve hafifçe alevden geçirildikten sonra, yakılmış bir platin uçlu iğne ile alınan sporlar besin ortamı üzerine zig-zag yapılarak bırakılır. Ekimden sonra şişenin ağzı yeniden alevden geçirilir ve pamuk tıpa ile kapatılır.
Ekim yapılan şişeler, Sporların çimlenmesi için 20-25°C sıcaklıktaki çimlendirme dolaplarında ve karanlıkta bırakılırlar. Sporların çimlenmesi için en elverişli sıcaklık düzeyi 22°C'dir. Çimlendirme süresi 21-30 gündür. Bu süre sonunda Sporların çimlenmesiyle miseller gelişmeye başlar. Gelişen miseller yeni malt-agar ortamları üzerine aşılanarak ana kültürler çoğaltılır.
Hem Sporların çimlendirilmesi, hem de ana kültür için çoğaltılması için kullanılan başka besin ortamları da mevcuttur. Örneğin; buğday-agar, yulaf-agar, patates dekstroz agar, bira mayası agar,havuç-glikoz agar, kompost agar gibi. Malt-agar ortamından sonra en fazla kullanılan besin ortamı olan buğday-agar'ın hazırlanışıda şöyledir: 125gr buğday tartılarak 4 lt saf su içerisinde iki saat kaynatılırve 24 saat bekletilir. Bu süre %2 oranında agar katılarak kaynama noktasına kadar ısıtılır ve daha sonra otoklavda 120°C'de 20 dakika tutularak sterilize edilir. Bu şekilde hazirlanan ortamlar özellikle ana kültür misellerinin çogaltilmasinda başarili sonuçlar vermektedir (Günay ve abak 1975).
Sporlarin ekilmesinde tekli spor yöntemi veya çoklu spor yöntemi kullanilir. Agaricus bisporus türünün Sporlarinin her biri teorik olarak tek başina verimli misel meydana getirebilir. Çünkü çogunlukla diploiddirler. Çoklu spor aşilamasi daha çok islah amaci ile yapilir. Farkli sporlardan meydana gelen hiflerin birleşmesi ile oluşan misellerden böylece degişik karakterler taşiyan yeni çeşitler elde edilebilir. Spordan misel elde etme yaninda dokulardan saf kültür elde ederek vegetatif çogaltmada yapilabilir. Her ne kadar bazi araştiricilar doku kültürü ile elde olunan misellerle yapilan üretimde verim düşüklügü görüldügünü belirtmekte iseler de, bunun tersini savunan yazarlarin sayisi da az degildir.
2.2.3.Tohumluk Miselin Hazirlanmasi
Ister spordan isterse dokudan meydana gelmiş olsun, elde edilen ana kültür şeklindeki miseller daha sonra kompost veya bugdaygil tohumlari üzerinde geliştirilerek tohumluk misel elde edilir. Hububat tohumu olarak, bugday, çavdar,dari ve süpürge otu tohumlari kullanilir. Hangi tohum kullanilirsa kullanilsin tohumluk misel elde etme şekli aynidir. O nedenle aşagida örnek olarak en fazla kullanilan bugday üzerinde hazirlanmiş tohumluk miselin yapimi anlatilmiştir.
Bunun için 10 kg bugday sicak su içerisinde 15-30 dakika kaynatilir. Sonra eleklere ve süzgeçli kovalara konarak suyu iyice süzülür. Bugday danelerinin üstü havada kurutulur. Bugday danelerinin kaynatilmasi zorunlu degildir. Ancak kaynatilmiyorsa bugdaylar ilkin 12-20 saat süreyle su içerisinde birakilir. Danelerin suyu iyice emmesi saglanir. Sonra yine suyu süzülüp üstü kurutulur. Kaynatmanin veya suda birakmanin amaci bugdayin içine su vermek,onu şişirmektir. Su verme işlemi bitince 10 kg bugdaya 50g kireç ve 200g alçi ilave edilir. Kireç ve alçi müştereken bugday daneleri ile kariştirilir. Kireç, ortamin pH degerinin 6-6.5'ta kalmasına yardım eder, alçı ise danelerin birbirine yapışmasını önler. Daha sonra 1 lt, sıcağa mukavim şişelere hacimlerinin 2/3'ü kadar buğday doldurulur. Ağzı pamuk veya alüminyum folyo ile sıkıca kapatılır. Şişeler otoklava konur ve 125-130ºC'de 1.5-2 saat süreyle sterilize edilir. Şişelerin büyüklügü ve içine konan bugday miktarina göre süre degişebilir. Süre, otoklav istenen sicakliga ulaştiktan sonra tutulur. Biraz uzun süre otoklavda birakmak, kisa süre birakmaktan iyidir. Ancak çok fazla sicakta ve fazla uzun süre birakma danelerin kurumasina yol açabilir. Bu durum ileride misellerin gelişmesinin nem azligindan yavaşlamasina neden olur. Işe yerine sicaga dayannikli şeffaf diger malzemelerde kullanilabilir. Süre sonunda isitmaya son verilir ve otoklav sogumaya birakilir. Kpagi açilip şişeler dişari çikarilir ve aşilama odasina alinir. U.V lambalar yakilir 6-7 saat sonra aşilama odasinin havasi tam steril hale getirilir. U.V işinlar söndürülür. Steril hava basilarak odada basinç yaratilir ve dişardan aşilama odasina hava girmesi önlenir. Bundan sonra ana kültürden parçalar alinarak şişelere bu kültürler konur, agizlari yine kapatilir. Çalişmaya steriliteyi bozmadan devam edilir.
Şişeler aşilandiktan sonra misel geliştirme odasina yerleştirilir. Burada 20-25ºC'de, %60-70 oransal nemde 20-30 günde miseller şişeyi sarar, Ortam sicakligi yükseldikçe misellerin bugdaylari sarma süresi kisalir. Yalniz sarmayi hizlandirmak için 10-15 gün sonra birinci, 20-25 gün sonra ikinci defa şişeler çalkalanir. Miseller şişe içine yayilir. Miseller tamamen şişe içine yayilinca aşilama odasindan alinip, kullanilacaksa saklanir yada aşilanir. Esasinda böyle bir şekil misel üretimini kolaylaştirir. Çünkü ana kültür şişesi ancak 2-3 tane bugday şişesini aşilar. Oysa iyi sarmiş bir dane bugday şişesi 50-100 adet yeni şişeyi aşilamaya yeter.
Aşilamayi iki kişinin yapmasi daha uygundur. Aşilama yaparken ana kültür ve dane şişesinin agzindaki pamuk ve şişe agizlari, aleve tutulmali ve aşilamadan sonra yine alevden geçirip kapatilmalidir. Aşilama sirasinda fazla hareketten kaçinilmali ve konuşulmamalidir. Eger aşilamada misel sardirilmiş şişeler kullanilacaksa bu şişeler önceden sallanip içindeki bugday topaklari parçalanmali ve dagitilmalidir. Temiz çalişilmadigi ve bulaşma oldugu zaman aşilamadan 2-3 gün önce bilhassa penicillum'lar yeşil renkleri ile şişe içindeki bugdaylar üzerinde çabucak görülürler. Bunun dişinda Aspergillum, mucor ve fusarium türleri de bulunabilir.1. hafta içinde de şişe içinde sulanmayla beraber bakteri enfeksiyonlari kendini belli eder. Bu tip enfeksiyonlu şişeler hemen ortamdan uzaklaştirilmali, laboratuvardan uzak bir yerde boşaltilip yakilarak imha edilmelidir. Degişik mantar çeşitlerinde misellerin maksimum depolama süresinin farkli oldugu çok sayida yapilmiş araştirmalarla ortaya konmuştur. Tohumluk miseller normal oda şartlarinda bir haftadan fazla saklanamaz. En iyi saklama sicakligi 2-4ºC'dir. Krem renkli çeşitlerin miselleri 2ºC'de iki ay depolama sonucu canlılığını kaybederken, beyaz renkli çeşitler 6 aydan fazla sürede bile rahatlıkla saklanabilirler. Sıvı azot içinde -160ºC'de miseller iki sene muhafaza edilmiş, bu süre sonunda ürün verme kabiliyeti kaybolmamiştir. Tohumluk miseller kuru olarak da çok uzun süre saklanabilir.
Karşilaştirmali verim denemelerinde, uzun süre saklanan misellerin veriminde düşme oldugunu belirleyen araştiricilar yaninda, herhangi bir farklilik olmadigini belirtenler de vardir. Optimal depolama süresi bu yüzden 20-30 gün olarak kabul edilir. Nakliye sirasinda da miseller canliligini yitirebilirler. Çogu kez kizişma meydana gelir. Taşima sirasinda miseller takviye edilmiş kagit torbalar ve karton kutular içine veya şişelere konulmalidir. Mantar miseli üreten firmalarin, ürettikleri misellerin verim kontrollerini yapmalari gerekir. Bunun içinde normal mantar üretim substratina dört tekrarlamali aşamalar yapilir. Tohumluk misel bu denemelerden sonra piyasaya sürülür. Dane tohumluk miseli geniş çapta kullanilmasina karşilik, son yillarda yeniden substrat tohumluk misel mantar üretiminin alt yillarinda en çok kullanilan şekil idi.
Tohumluk misel üretiminde kullanilacak substratin hazirlanişi aslinda normal mantar yetiştirilmesinde kullanilan kompostundakine benzemekle birlikte bazi ayricaliklari da vardir. Kompost , at gübresi veya bugday sapiyla hazirlanir. 1. Fermantasyona ugratilir. Normal kompost misel üretimine uygun degildir. Içinde suda çözünmüş veya serbest halde amonyak bulunabilir ve amonyak misel gelişmesini önler. Bu nedenle tohumluk misel üretiminde kullanilacak kompostun fermantasyondan sonra laboratuvarda uzun süre yikanmasi ve amonyaginin giderilmesi gerekir. Tohumluk misel yapiminda kullanilacak iyi bir kompost kahverenginde, kirilgan fakat elastik olmali, amonyak kokusundan arinmiş bulunmalidir. Elle sikildiginda su damlamamali nem orani %55-60 arasinda olmalidir. Bu amçla kompost preslenip fazla suyu akitilir. Böylece hazirlanan kompost ya hububat danelerinde oldugu gibi şişelere konulup otoklavda sterilize edildikten sonra misel aşilamasinda kullanilir, Ya da plastik torbalarda paket halinde tohumluk misel yapilir. Ikinci durumda kompost önce 4-5 cm genişlikte 20 cm uzunlukta kaplarin içine preslenir, kaplarin agzi kapatilir ve otoklavda sterilize edilir. Otoklavdan çikarilan ve sogutulan kompost, kaplardan plastik torbalara alinir ve aşilanir. Torbalarin agzi preslenerek 20-25ºC arasındaki geliştirme odasına yerleştirilir. 6-8 hafta içinde miseller ortamı iyice sarar ve tohumluk misel elde edilir.
Misellerin Çoğaltılması ve Tohumluk Misellerin Hazırlanması
8.2.3. Misellerin Kirle Edilmesi, Çoğaltılması ve Tohumluk Misellerin Hazırlanması
Tohumluk misellerin temizliği ve kalitesi, mantar yetiştiriciliği açısından büyük öneme sahiptir. Zira. kültürün geleceği, kullanılan tohumluk misele bağlıdır. Miselin yalnızca steril koşullarda hazırlanması ve temiz olması yeterli bir özellik değildir. Tohumluk misel aynı zamanda mantar türünün kendine özgü özelliklerini de bünyesinde (genotipinide) taşımalıdır.
Temizliğin sağlanması için, misel üretimi sırasında steril koşulların bulunması ve korunması gerekir. Kuru ortamda yabancı ve zararlı organizmaların gelişmesinin azalacağı unutulmamalıdır. Bu nedenle misel üretim laboratuvarı steril olarak havalandırılmak ve ortam içinden belirli odalar dışında nemin fazlaca oluşmasına izin verilmemelidir. Misel üretim laboratuvarının en az haftada bir defa havası kontrol edilmeli ve havadaki mikroorganizmaların sayısının çeşidinin tesbiti yapılmalıdır. Bunun için, petri kutularına besin maddeli agar koyup, petri kutularını laboratuvarın çeşitli yerlerinde, ağzı açık vaziyette 20 dakika süre ile bekletmeli, sonra ağzı kapatılarak, 24-26 C 'deki inkubasyon dolabına konmalıdır. Bir kaç gün içinde petri kabı içinde herhangi bir mikroorganizma ürememiş ise laboratuvarımızm havası temizdir. Eğer üreme meydana gelmişse, bunun ne olduğu ve miktarının laboratuvar için tehlikeli boyutta olup olmadığı araştırılmalıdır. Yaz aylarında mikroorganizma üreme şansı, kış aylarına oranla daha fazladır. Yaz aylarında en yoğun devrede, laboratuvar havasında % 5 'e kadar yabancı organizma bulunmasına izin verilebilir. Mikroorganizma sayısı fazla ise hemen gerekli önlemler alınmalıdır. Bunun için, öncelikle temizlik sistemi yeniden kontrol edilmeli, havalandırma filtrelerine bakılmalıdır. Tespit edilen organizmanın durumuna göre gerekli ilaçlama yapılmalıdır.
Misel üretim laboratuvarında çalışan işçilere laboratuvar koşullarının temiz tutulması önlemleri anlatılmalı, öncelikle kendi beden ve giysilerinin temizliğinin nasıl yapılacağı öğretilmelidir. Çalışmaya başlamadan önce eller kesinlikle yıkanmalı ve sonra temiz elbiseler giyilmelidir. Her kullanımdan sonra elbiseler kağıtlara sarılıp otoklava veya kurutma dolabına yerleştirilmeli ve burada 130 C 'de iki saat süreyle steril hale getirilmelidir. Sterilizasyon süresi sonunda kağıda sarılı şekilde çıkarılıp temiz bir dolapta tekrar kullanıma kadar kapalı muhafaza edilmelidir.
Mantar kompost yapımında veya üretiminde çalışan işçiler veya personel kesinlikle misel laboratuvarına sokulmamalıdır. Bunların nefeslerinden bile laboratuvara hastalık taşıyacakları öğretilmelidir.
Tohumluk misel üretim laboratuvarı için çok önemli olan bu hijyenik bilgileri bir kere daha hatırlattıktan sonra, tohumluk misel üretiminin nasıl yapılacağına geçebiliriz.
Tohumluk misel üretiminde üç safha bulunur. Birinci safha tohumluk misel üreminde kullanılacak anaçlık mantarların seçilmesi, bu mantarlardan sporların alınmasıdır. İkinci safha ana kültürlerin hazırlanması ve üçüncü safha ise, ana kültürler yardımı ile ticari tohumluk misellerin elde edilmesidir.
a. Birinci safha (Anaç mantarların seçimi ve sporların alınması)
Anaç mantarların seçimi, üretimi yapılacak çeşidin genç ve sağlıklı ilk ve ikinci flaşında yapılmalıdır. Seçilen mantarlar çeşidin tipik özelliğini göstermelidir. Bu amaçla büyümekte olan mantarlar kontrol altına alınır. Hastalıksız, şapkası geniş ve geç açılan, kısa saplı, kalın meyve etine sahip mantarlar işaretlenir. Seçilen mantarların hasadı, şapkanın saptan ayrılmasına yakın bir zamanda, yani şapka açmadan biraz önce, mantarlar tam büyüklüğünü aldıkları zaman yapılmalıdır. Hasat edilen mantarlar laboratuvara getirilir. Önce toprakları temizlenir, daha sonra sapları 1 cm uzunlukta kalacak şekilde kesilir. Böylece şapka kısmı dengeli bir şekilde oturtulabilir. Son olarak mantarın tüm yüzeyi %70 'lik alkole batırılmış pamuk yardımı ile silinir ve hızlı bir şekilde alevden geçirilerek dezenfekte edilir. Dış yüzeyin dezenfeksiyonu için diğer bir yöntem, mantarları %1 'lik potasyum permanganat eriğinde bir kaç dakika tutup, sonra % 70 'lik alkole batırıp, hemen alevden geçirmedir. Dezenfekte edilmiş mantarlar temiz beyaz bir karton veya cam üzerine sap ve lameller aşağı gelecek şekilde oturtulur. Hava akımını engellemek ve aseptik koşulları sürdürmek amacı ile üzerine cam fanus kapatılır. Normal oda sıcaklığında birkaç gün sonra şapka kendiliğinden açılır, sporlar cam ve karton üzerine dökülmeye başlar. Dışardan bakıldığında, mantar şapkası altında karton ve cam üzerinde dökülmüş sporlardan oluşan siyah kahverengi bir iz tespit edilir. STOLLER ve STAUFFER (1954) eserlerinde 18-19C 'de bırakılan mantar şapkalarının bol miktarda spor verdiklerini açıklamaktadır. Sporlar bir suluboya fırçası yardımıyla toplanıp, cam kaplara konur. Kapların ağızları kapatılır. Eğer hastalıkla bulaşma olasılığı varsa, spor bulunan cam kaplar etüvde 70C 'de 30-60 dakika tutularak Zaralılardan ve özellikle virüslerden arındırılır. Viruslar mantar üretiminde önemli zararlanmalar meydana getirir. Bulaşma spor elde edilirken daha çok ortaya çıkar. Bu bakımdan sıcaklık uygulaması zararlılardan arındırmak için iyi bir yöntemdir. Olaydan daha da emin olmak için, Almanya'da Hamburg Volksdof daki Max Planck enstitüsünde yapılan virüs testine baş vurmalıdır. Bu testte, sıcaklık uygulamasından sonra, sporlar besin eriği bulunan petri kaplarına ekilir. Kapların bir kısmı 20C, diğer bir kısmı 30°C 'deki çimlendirme dolaplarına konur. Sporlarda virüs yok ise, her iki sıcaklıkta da çimlenme ve büyüme aynıdır. Ancak 20C 'deki biraz öncelik kazanır. Virüs varsa 30°C 'ye konmuş petri kabında, virüsün gelişmesi bastırıldığından, mantar miselleri çabuk, buna karşılık 20°C 'dekiler çok yavaş ve uzun sürede
büyür.
Steril hale getirilen sporlar kapalı şekilde buz dolaplarında muhafaza edilir. CAYLEY (1936) ya göre kuru ve serin bir yerde mantar sporlarının altı ay canlı kaldığı görülmüştür. MZOYNİ (1967) ise, mantar sporlarım 5-8°C 'de 4 ay ile, 3-6 yıl arasında muhafaza etmiştir. 6 yıl sonra bile sporların canlı kaldığını tespit etmiştir. Yine sporları 0°C 'de saklayan KNEEBONE (1969), 36 yıl sonunda sporlarda çimlenme meydana geldiğini ve bu misellerden ürün alındığını bildirmektedir.
b. İkinci safha (Sporların çimlendirilmesi ve ana kültürün hazırlanması)
Sporların çimlendirilmesi ve misel elde edilmesi steril koşullarda ve besi ortamları üzerinde yapılır. Besin kaynağı olarak şeker, pepton veya diğer organik maddelerden yararlanılır ve ortamın katılığı agarla ayarlanır.'
Bazı mantarların sporları kolay çimlendiği halde, bazılarınınki sorun yaratır. Bu sorunlu durumlarda, ortama ayrıca bazı kimyasal veya hormon karakterinde maddeleri ilave etmek gerekir. MZOYNİ (1967) bu konda ortama bal, kloroform katıldığında Agaricus macrosporus sporlarının çimlenme süresinin 8 gün kısaltılabildiğini açıklamaktadır. RAST ve STAUBLE (1970) ise, izoamil alkol ve izovalerik asit'in Agaricus bisporus'ta çimlenmeyi daha iyi uyardığını belirtmektedir. Bizim yaptığımız çalışmalarda, Agaricus bisporus'un sporlarını çimlendirmede, besi ortamına hiçbir özel katkı maddesi ilave etmeden, direk Malt-agar besi ortamında kolayca çimlendikleri tespit edilmiştir.
Sporların çimlendirilmesinde araştırıcılar değişik ortamlar kullanır.Bu besi ortamlarından bir kaçı Malt-agar; Buğday-agar; Yulaf-agar; patates dekstroz-agar; bira mayası-agar; havuç, glikoz-agar ve kompost-agar 'dır. Bunların içinde en fazla kullanılanları Malt ve Buğday-agar 'dır.
Malt-agar ortamının hazırlanmasında, 1 LT suya 16 g malt katılır. Ortamın pH 'sı 6-6,5 'e ayarlanır. Karışım kaynama noktasına gelinceye kadar ısıtılır. Eriyik soğumadan, 125 ml 'lik yassı cam şişelere veya 5-7 cm' lik petri kaplarına 25 ml olacak şekilde doldurulur. Şişelerin ağzı pamuk tıkaçla veya plastik kapakla, petriler cam kapakla kapanır, sonra otoklava yerleştirilir. 120°C sıcaklıkta 15-20 dakika sterilize edilir. 20 dakikadan fazla sterilizasyon, agarın yapısını bozacağı ve katılaşmayı önleyeceği için, verilen süre aşılmamalıdır. Otoklavdan alınan şişeler 10-15° meyilli, petriler düz bir zemine konur. Soğutulur ve agarın donması, katılaşması sağlanır.
Buğday agar hazırlamak için, 125 g buğday tartılıp, 4 lt saf suda iki saat kaynatılır ve 24 saat olduğu gibi bekletilir. Süre sonunda süzülüp, süzüntü içine tekrar saf su konarak 4 lt'ye tamamlanır. İçerisine % 2 oranında agar katılarak, kaynama noktasına kadar ısıtılır. Bundan sonraki işlemler malt-agarda olduğu gibidir.
Ortamlar hazırlandığında, bunlar steril aşılama odasına alınır. Burada bir kişi alev altında petri kabının kapağını veya şişelerin ağzını açar. Diğer kişi steril cam kaplarda bulunan sporlardan, alevden geçirilmiş ok ucu iğne veya bıçakla alarak besin ortamı üzerine eker. sonra ortamların ağızı yine alevden geçirilerek kapatılır. Bu işlemler mümkün olduğu kadar çok çabuk yapılır. İşlem yapılırken konuşmamalı, derin nefes alınmamalıdır. Şayet ağızda maske bulunursa, bu tedbirleri almaya gerek kalmaz Sporların ekilmesinde tekli veya çoklu spor yöntemi uygulanır. Tek bir sporu 2n (diploid) yapıda ve sporları çimlendiği zaman sekonder miseller veren türler, verimli sporlara sahiptir. Bunların sporlarının tek tek ekilmesinde bir sakınca yoktur. Tek spor ekiminden, her spor kendi başına çimlenerek tek bir misel meydana getirir. Bu misel çoğaltılarak saf,hatlar elde olunabilir. Sekonder misellere sahip sporların çoklu halde ekilmesi üretim, tek ekilmesi ıslah amaçlıdır. Sporların çimlenmesiyle primer hifler meydana geliyorsa, bunların verimli hale gelmesi için, iki farklı cinsiyette miselin birleşmesi ve sekonder misel meydana getirmesi gerekir. Bunun için bu türlerde özellikle çoklu spor aşılaması yapılır. Daha sonra sekonder miseller tek tek alınıp, hat oluşumuna gidilir. Normal mantar üretiminde, önemli olan verimli misel elde etmektir. Islahta amaca göre tekli veya çoklu spor yönteminden birisi seçilir.
Misel elde etmede sporlar yanında doku parçalan da kullanılabilir. Anaçlık seçilmiş mantarlar steril aşılama odasına alınır. Üstleri dezenfekte edilir. Sonra mantarın kabuk kısmı kaldırılıp alttaki etli dokudan ufak bir parça alınıp besin eriği üzerine konur. 20-40 gün zarfında bu doku parçası etrafında miseller oluşmaya başlar.
Spor veya doku parçası ekilmiş ortamlar çimlendirme dolaplarına yerleştirilir. Dolap sıcaklığı 20-25"C 'ye ayarlanır. Karanlık koşullarda 20-40 gün içinde sporların çimlenmesiyle oluşan hifler, bölünerek çoğalır ve kabın her tarafını miseller kaplar. Bu hazırlanan ortama "ANA KÜLTÜR" adı verilir (Şekil 8.10).
Ana kültür hazırlanırken bazı önemli sorunlarla karşılaşabiliriz. Cetvel 8.9 'de bu sorunlar ve çözüm yollan verilmiştir.
c. Üçüncü safha (Tohumluk misellerin hazırlanması)
İster spordan, ister dokudan elde edilmiş ana kültür halindeki misellerden alınarak, daha sonra kompost veya bir tohum üzerine aşılanarak ve burada tohumlara sardırarak tohumluk misel elde edilir. Bu ilk elde olunan tohumluk misellerde de, aynı işlem tekrar yapılarak çok daha fazla çoğaltılır ve üreticilere satış için ticari tohumluk meydana getirilir. Tohumluk ve ticari tohumluğunun yapılış yolu aynıdır. Bir şişedeki veya petri kabındaki ana kültürden genel olarak 10 şişe bir litrelik 1. el tohumluk misel; her bir tohumluk şişeden 100-1.000 adet 2. el tohumluk misel; 2. el tohumluğunda çoğaltılmasıyla, ticari tohumluk elde olunacağı düşünülür.
Ticari tohumluğun üretildiği ortamlar oldukça farklılık gösterir. Genelde katı ve sıvı iki guruba ayrılır. Ahır gübresi; at gübresi; kompost; buğday, çavdar, darı, mısır, süpürge otu tohumları; besin maddesi doyrulmuş kepek ve perlit ayrı ayrı ve ikisinin karışımları üzerinde geliştirilmiş misellerden elde edilen tohumluk, katı tohumluğu; sıvı besin ortamlarında geliştirilmiş misellerden elde edilen tohumluk, sıvı tohumluğu (püskürtme yaparak aşılama) meydana getirir (Şekil 8.11 ve 8.12). Bu tohumluklar içinde en fazla kullanılanı buğday, çavdar ve darı üzerine sardırılmış tohumluktur. Bu katı tohumluk, diğer katı tohumluktan ayrılarak ve özel bir isim verilerek dane tohumluk olarak bilinir. Dane tohumluğun, diğer materyaller üzerinde üretilen tohumluğa karşın bazı avantajları vardır. Bir litrede, buğday tohumluğunda yaklaşık 24.000 adet, darıda ise 70.000 adet dane tohum bulunmaktadır. Kompost içine tohumluğun ekilmesinde dane sayısı ne kadar artarsa, aşılanma yüzeyi o kadar fazlalaşacak ve miselin kompostu sarma süresi kısalacaktır. Bu avantajlardan dolayı başlangıç yıllarında fazla kullanılan gübre tohumluğu giderek silinmiştir. Ancak dane tohumluğun da, büyük avantajları yanında bazı dezavantajları bulunmaktadır. Dane tohumluk keneler ve fareler için cazip bir yiyecektir ve mantarhanede barınmalarına olanak teşkil eder. Bir diğer istenmeyen yanı, yeşil küflere çabuk yakalanmalarıdır. Dane tohumluğun bu kötü yanlarından dolayı, günümüzde diğer bazı tohumluk materyal arayışları devam etmektedir. Bunlar perlit gibi toz veya sıvı tohumluklar olup, uygulamada henüz kesin sonuçlar alınmamış ve araştırmalarına şu anda devam edilmektedir. Günümüzün en çok kullanılan dane tohumluğun yapılış şekli, kullanılan tohum türleri
I farklı bile olsa, yapılış sistemi bir birine çok benzer. Bu bakımdan, burada buğday tohumluğu ele alınarak anlatım yapılacaktır.
10 kg buğday bol sıcak su içinde 15-30 dakika kaynatılır. Bu sırada buğday daneleri hafif pişmeli ve su emerek yumuşamalıdır. Ancak taneler fazla şişerek ve su alarak çatlamış, bünyesindeki nişastalı maddelerin suda erimiş salgısı, çatlamış kısımlardan ortam içine çıkmış ve ortama bulaşmış durumda olmamalıdır. Şişelere salgının bulaşması, ilerde şişeler içinde mantari ve bakteriyel hastalıkların çabucak üremesine yol açar. Buğdaylar yumuşayınca elek telleri üzerine dökülüp suyu süzülür ve danelerin yüzeysel kuruması sağlanır. Materyalin fazlalığına ve işi çabuklaştırmaya bağlı olarak, kurutma sırasında gerekirse vantilatör veya aspiratör kullanılır. Böylece tohumların üst yüzeyin kurutulması hızlandırılır.
Kaynatma yerine tohumların su emeceği, şişeceği, yumuşayacağı ve çatlamanın daha az olacağı diğer bir yol, tohumları su içinde 10-30 saat süre ile bekletmedir. Süre sonunda tohumların sudan alınıp süzülmesi ve üst yüzeylerinin kurutulması yapılır.
Üst yüzey kuruduktan sonra, 10 kg buğdaya 50 g kireç, 200 g alçı ilave edilip, çok iyi karıştırılır. Kireç ve alçının bütün danelerin üst yüzeyini kaplamasına özen gösterilir. Bazı araştırma sonuçlarında ortama katılacak kirecin %0,3: alçının % 1,3 olması tavsiye edilir. Kireç ortamı pH'nın 6-6,6' te kalmasını, alçı ise danelerin birbirine yapışmasını önler. Bu bakımdan katılacak kireç ve alçı oranı, esasında ortamın pH durumuna göre hesaplanmalıdır. Materyal, daha sonra 1 veya 5 lt 'ye kadar hacmi olan şişelere, şişe hacminin 2/3 'ne kadar doldurulur. Ağızları özel kapaklarla kapatılarak, kapak yoksa önce pamuk tıkaç sokulup, sonra alimünyum folye ile üzeri güzelce sarılır. Alimünyum folye şişe içindeki nemin kaçmasını önler. Alimünyum folye yoksa, aynı görevi kağıt parçası da yapabilir. Son yıllarda cam şişelerin yerini içi görülebilen sıcağa dayanıklı plastik kaplar veya torbalar almaktadır. Bunlar hafif olduklarından ve fiyatları ucuz bulunduğundan, misel üretim sonrası satışın doğrudan bu kaplar içinde yapılmasından, ayrıca paketlemeye gerek duyulmamasından kullanımları giderek yaygınlaşmaktadır.
Buraya kadar anlatılanlar, misel laboratuvarının ön hazırlık odasında gerçekleştirilir. Bu odada bulunan otoklavın kapağı açılıp, şişeler otoklava konur. Ağzı kapatılır ve otoklav 125-130°C 'de 1,5-2 saat süreyle çalıştırılıp, şişeler içindeki materyal sterilize edilir. Otoklav çalıştırıldığında, sıcaklık artarken meydana gelen basınç, otoklav iç havasının şişmesine neden olur. Şişen havanın dışarı çıkması için, basınç vanası açık tutulur. Sıcaklık 100°C 'ye geldiğinde otoklavda artık basınçlı hava kalmaz ve vana kapatılır. Şişelerin otoklav süresi, şişe büyüklüğüne, içine konan materyalin özelliğine göre ayarlanır. Materyal daha steril olsun diye, uzun süre veya ekonomik olsun diye daha kısa süre tutmak doğru değildir. Sterilizasyon süresi sonunda otoklavın çalışması durdurulur, kendi haline soğumaya bırakılır. Sıcaklık 80°C 'ye geldiğinde otoklavın basınç vanası açılıp içindeki basınç düşürülür. Sonra otoklav sıcaklığı 60°C 'ye geldiğinde, otoklavın aşılama odası tarafındaki kapağı açılır.
Şişeler sıcak sıcak otoklav odası kısmından, misel aşılama odasına götürülür. Burada bulunan tezgahlara konur ve 20-30°C 'ye soğuyuncaya kadar beklenir. Bu sırada aşılama odasının kapıları kapanır ve ultraviole lambalar en az 12 saat yakılır.
Sürekli misel üreten ve aşılama yapan, tohumculuk firmalarında bir kaç otoklav bulunur. Otoklav basınç vanası' açılıp, basınç düşürüldükten sonra kapağı açılıp, otoklav içinden alınan materyal aşılama odasının otoklav kısmına konur. Şişelerin 20-30°C 'ye kadar soğuması beklenir. Sonra şişeler bant yardımı ile aşılama odasına alınır. Sürekli çalışan laboratuvarlarda ultraviole lambalar ancak, işin sona erdiği ve odada kimsenin bulunmadığı gece saatlerinde yakılır.
Şişeler istenen sıcaklık derecesine ulaşınca aşılama yapılır. Önce ultraviole lamba söndürülür. 10-15 dakika beklenir. Bu sırada odaya steril hava basılır. Sonra odaya steril elbise giyilmiş, ağız ve buruna maske takılmış olarak girilir. Aşılama odasına dışardan devamlı taze hava verildiğinden, oda içi basıncı arttığından, oda içindeki hava devamlı dışarı çıkar. Böylece dışardaki kirli havanın içeri sızması önlenir. Odadaki iki kişiden birisi aşılama yapılacak şişelerin ağzını alev üzerinde açar. Diğeri, aşılama kullanılacak ana kültür şişesini veya tohumluk şişesini açar (Şekil 8.13). Ana kültürden aşılama yapılacaksa, bir bıçak yardımı ile besin ortamından bir parçayı alıp, aşılanacak şişe içindeki materyalin üzerine bırakır. Tohumluk materyal kullanılacaksa, bu şişeyi önce sallayarak içindeki materyalin parçalanması sağlanmalı, sonra bir pens yardımı ile 5-10 adet dane alıp, aşılama yapılmalıdır. Aşılama bitince şişelerin ağızları aleve tutularak kapatılır. Şişeler yan tezgah üzerine yığılır. İşleme devam edilerek bütün şişeler aşılanır. Daha sonra aşılanan şişeler hemen misel geliştirme odasına götürülür. Aşılama odası temizlenerek bırakılır.
Misel geliştirme odasında şişeler raflara 15-20 derece meyille konur. Oda içinde 20-25°C sıcaklık ve % 70-80 nem bulunur. 20-30 gün sonunda aşılanmış miseller bütün şişeyi sarar (Şekil 8.14). Sarmayı hızlandırmak için, 6.-7. günden sonra şişeleri 4-5 gün aralıklarla bir veya 2 defa sarsaklamakta yarar vardır. Sıcaklığın biraz yükseltilmesi de çabuk sarmaya olumlu etki yapar.
Tohum üretim laboratuvarında temiz çalışılmaz veya dikkatsizlik sonucu hastalık bulaşması olursa, bu şişelerde penicillium, mucor, fusarium, sarı ve kahverengi küf, virüs, bakteri gibi hastalıklar meydana gelir. Bunların bir kısmı, yeşil, mavi, kırmızı, pembe, kahverengi, siyah gibi değişik renkler, şişe içinde oluşan yapışkan sıvı ile, şişe dışından, diğer bir kısmı şişe açıldığında etrafa yaydığı kokudan çabucak tanınır. Şişeleri sarsaklamanın iyi bir yanı, şişe içinde gelişen, dışardan görülmeyen hastalıkları ortaya çıkarmasıdır. Hastalıklı şişeler hemen üretim odasından alınır. Otoklav edilerek içindeki zararlıların ölmesi sağlanır. Sonra ağızları açılıp şişeler temizlenmeye alınır.
Şekil 8.14. Aşılama Sonrası Misel Gelişmiş 1 kg'lik Tohumluk Şişesi
Sarma işlemi tamamlanan şişeler depoya konur. Satışa veya kullanıma kadar soğuk hava deposunda muhafaza edilir. Tohumluk miseller en fazla 10-15 gün 2-4°C 'de muhafaza edilmelidir. Ticari tohumluk olarak üretimde kullanılacak miseller de bu süre 30-50 güne kadar çıkabilmektedir. Ancak çeşit muhafazası için tohumluğun saklanması, daha önce de belirttiğimiz gibi 0°C 'de uzun yıllar yapılabilmektedir.
Saklama sırasında olduğu kadar, misellerin taşınmaları sırasında da dikkatli davranmak gerekir. Ambalajların çok büyük, sıkışık yapılması, yüksek sıcaklıklarda ve uzun süreli nakledilmesi, kızışmaya ve tohumluk içinde sıcaklığın 30°C üzerine çıkıp, misellerin ölmesine ve en kötü şekliyle aktivitesinin yavaşlamasına neden olabilir.
Kaynak: Mantar Yetiştiriciliği Kitabı Prof. Dr. Atila GÜNAY
Tohumluk misellerin temizliği ve kalitesi, mantar yetiştiriciliği açısından büyük öneme sahiptir. Zira. kültürün geleceği, kullanılan tohumluk misele bağlıdır. Miselin yalnızca steril koşullarda hazırlanması ve temiz olması yeterli bir özellik değildir. Tohumluk misel aynı zamanda mantar türünün kendine özgü özelliklerini de bünyesinde (genotipinide) taşımalıdır.
Temizliğin sağlanması için, misel üretimi sırasında steril koşulların bulunması ve korunması gerekir. Kuru ortamda yabancı ve zararlı organizmaların gelişmesinin azalacağı unutulmamalıdır. Bu nedenle misel üretim laboratuvarı steril olarak havalandırılmak ve ortam içinden belirli odalar dışında nemin fazlaca oluşmasına izin verilmemelidir. Misel üretim laboratuvarının en az haftada bir defa havası kontrol edilmeli ve havadaki mikroorganizmaların sayısının çeşidinin tesbiti yapılmalıdır. Bunun için, petri kutularına besin maddeli agar koyup, petri kutularını laboratuvarın çeşitli yerlerinde, ağzı açık vaziyette 20 dakika süre ile bekletmeli, sonra ağzı kapatılarak, 24-26 C 'deki inkubasyon dolabına konmalıdır. Bir kaç gün içinde petri kabı içinde herhangi bir mikroorganizma ürememiş ise laboratuvarımızm havası temizdir. Eğer üreme meydana gelmişse, bunun ne olduğu ve miktarının laboratuvar için tehlikeli boyutta olup olmadığı araştırılmalıdır. Yaz aylarında mikroorganizma üreme şansı, kış aylarına oranla daha fazladır. Yaz aylarında en yoğun devrede, laboratuvar havasında % 5 'e kadar yabancı organizma bulunmasına izin verilebilir. Mikroorganizma sayısı fazla ise hemen gerekli önlemler alınmalıdır. Bunun için, öncelikle temizlik sistemi yeniden kontrol edilmeli, havalandırma filtrelerine bakılmalıdır. Tespit edilen organizmanın durumuna göre gerekli ilaçlama yapılmalıdır.
Misel üretim laboratuvarında çalışan işçilere laboratuvar koşullarının temiz tutulması önlemleri anlatılmalı, öncelikle kendi beden ve giysilerinin temizliğinin nasıl yapılacağı öğretilmelidir. Çalışmaya başlamadan önce eller kesinlikle yıkanmalı ve sonra temiz elbiseler giyilmelidir. Her kullanımdan sonra elbiseler kağıtlara sarılıp otoklava veya kurutma dolabına yerleştirilmeli ve burada 130 C 'de iki saat süreyle steril hale getirilmelidir. Sterilizasyon süresi sonunda kağıda sarılı şekilde çıkarılıp temiz bir dolapta tekrar kullanıma kadar kapalı muhafaza edilmelidir.
Mantar kompost yapımında veya üretiminde çalışan işçiler veya personel kesinlikle misel laboratuvarına sokulmamalıdır. Bunların nefeslerinden bile laboratuvara hastalık taşıyacakları öğretilmelidir.
Tohumluk misel üretim laboratuvarı için çok önemli olan bu hijyenik bilgileri bir kere daha hatırlattıktan sonra, tohumluk misel üretiminin nasıl yapılacağına geçebiliriz.
Tohumluk misel üretiminde üç safha bulunur. Birinci safha tohumluk misel üreminde kullanılacak anaçlık mantarların seçilmesi, bu mantarlardan sporların alınmasıdır. İkinci safha ana kültürlerin hazırlanması ve üçüncü safha ise, ana kültürler yardımı ile ticari tohumluk misellerin elde edilmesidir.
a. Birinci safha (Anaç mantarların seçimi ve sporların alınması)
Anaç mantarların seçimi, üretimi yapılacak çeşidin genç ve sağlıklı ilk ve ikinci flaşında yapılmalıdır. Seçilen mantarlar çeşidin tipik özelliğini göstermelidir. Bu amaçla büyümekte olan mantarlar kontrol altına alınır. Hastalıksız, şapkası geniş ve geç açılan, kısa saplı, kalın meyve etine sahip mantarlar işaretlenir. Seçilen mantarların hasadı, şapkanın saptan ayrılmasına yakın bir zamanda, yani şapka açmadan biraz önce, mantarlar tam büyüklüğünü aldıkları zaman yapılmalıdır. Hasat edilen mantarlar laboratuvara getirilir. Önce toprakları temizlenir, daha sonra sapları 1 cm uzunlukta kalacak şekilde kesilir. Böylece şapka kısmı dengeli bir şekilde oturtulabilir. Son olarak mantarın tüm yüzeyi %70 'lik alkole batırılmış pamuk yardımı ile silinir ve hızlı bir şekilde alevden geçirilerek dezenfekte edilir. Dış yüzeyin dezenfeksiyonu için diğer bir yöntem, mantarları %1 'lik potasyum permanganat eriğinde bir kaç dakika tutup, sonra % 70 'lik alkole batırıp, hemen alevden geçirmedir. Dezenfekte edilmiş mantarlar temiz beyaz bir karton veya cam üzerine sap ve lameller aşağı gelecek şekilde oturtulur. Hava akımını engellemek ve aseptik koşulları sürdürmek amacı ile üzerine cam fanus kapatılır. Normal oda sıcaklığında birkaç gün sonra şapka kendiliğinden açılır, sporlar cam ve karton üzerine dökülmeye başlar. Dışardan bakıldığında, mantar şapkası altında karton ve cam üzerinde dökülmüş sporlardan oluşan siyah kahverengi bir iz tespit edilir. STOLLER ve STAUFFER (1954) eserlerinde 18-19C 'de bırakılan mantar şapkalarının bol miktarda spor verdiklerini açıklamaktadır. Sporlar bir suluboya fırçası yardımıyla toplanıp, cam kaplara konur. Kapların ağızları kapatılır. Eğer hastalıkla bulaşma olasılığı varsa, spor bulunan cam kaplar etüvde 70C 'de 30-60 dakika tutularak Zaralılardan ve özellikle virüslerden arındırılır. Viruslar mantar üretiminde önemli zararlanmalar meydana getirir. Bulaşma spor elde edilirken daha çok ortaya çıkar. Bu bakımdan sıcaklık uygulaması zararlılardan arındırmak için iyi bir yöntemdir. Olaydan daha da emin olmak için, Almanya'da Hamburg Volksdof daki Max Planck enstitüsünde yapılan virüs testine baş vurmalıdır. Bu testte, sıcaklık uygulamasından sonra, sporlar besin eriği bulunan petri kaplarına ekilir. Kapların bir kısmı 20C, diğer bir kısmı 30°C 'deki çimlendirme dolaplarına konur. Sporlarda virüs yok ise, her iki sıcaklıkta da çimlenme ve büyüme aynıdır. Ancak 20C 'deki biraz öncelik kazanır. Virüs varsa 30°C 'ye konmuş petri kabında, virüsün gelişmesi bastırıldığından, mantar miselleri çabuk, buna karşılık 20°C 'dekiler çok yavaş ve uzun sürede
büyür.
Steril hale getirilen sporlar kapalı şekilde buz dolaplarında muhafaza edilir. CAYLEY (1936) ya göre kuru ve serin bir yerde mantar sporlarının altı ay canlı kaldığı görülmüştür. MZOYNİ (1967) ise, mantar sporlarım 5-8°C 'de 4 ay ile, 3-6 yıl arasında muhafaza etmiştir. 6 yıl sonra bile sporların canlı kaldığını tespit etmiştir. Yine sporları 0°C 'de saklayan KNEEBONE (1969), 36 yıl sonunda sporlarda çimlenme meydana geldiğini ve bu misellerden ürün alındığını bildirmektedir.
b. İkinci safha (Sporların çimlendirilmesi ve ana kültürün hazırlanması)
Sporların çimlendirilmesi ve misel elde edilmesi steril koşullarda ve besi ortamları üzerinde yapılır. Besin kaynağı olarak şeker, pepton veya diğer organik maddelerden yararlanılır ve ortamın katılığı agarla ayarlanır.'
Bazı mantarların sporları kolay çimlendiği halde, bazılarınınki sorun yaratır. Bu sorunlu durumlarda, ortama ayrıca bazı kimyasal veya hormon karakterinde maddeleri ilave etmek gerekir. MZOYNİ (1967) bu konda ortama bal, kloroform katıldığında Agaricus macrosporus sporlarının çimlenme süresinin 8 gün kısaltılabildiğini açıklamaktadır. RAST ve STAUBLE (1970) ise, izoamil alkol ve izovalerik asit'in Agaricus bisporus'ta çimlenmeyi daha iyi uyardığını belirtmektedir. Bizim yaptığımız çalışmalarda, Agaricus bisporus'un sporlarını çimlendirmede, besi ortamına hiçbir özel katkı maddesi ilave etmeden, direk Malt-agar besi ortamında kolayca çimlendikleri tespit edilmiştir.
Sporların çimlendirilmesinde araştırıcılar değişik ortamlar kullanır.Bu besi ortamlarından bir kaçı Malt-agar; Buğday-agar; Yulaf-agar; patates dekstroz-agar; bira mayası-agar; havuç, glikoz-agar ve kompost-agar 'dır. Bunların içinde en fazla kullanılanları Malt ve Buğday-agar 'dır.
Malt-agar ortamının hazırlanmasında, 1 LT suya 16 g malt katılır. Ortamın pH 'sı 6-6,5 'e ayarlanır. Karışım kaynama noktasına gelinceye kadar ısıtılır. Eriyik soğumadan, 125 ml 'lik yassı cam şişelere veya 5-7 cm' lik petri kaplarına 25 ml olacak şekilde doldurulur. Şişelerin ağzı pamuk tıkaçla veya plastik kapakla, petriler cam kapakla kapanır, sonra otoklava yerleştirilir. 120°C sıcaklıkta 15-20 dakika sterilize edilir. 20 dakikadan fazla sterilizasyon, agarın yapısını bozacağı ve katılaşmayı önleyeceği için, verilen süre aşılmamalıdır. Otoklavdan alınan şişeler 10-15° meyilli, petriler düz bir zemine konur. Soğutulur ve agarın donması, katılaşması sağlanır.
Buğday agar hazırlamak için, 125 g buğday tartılıp, 4 lt saf suda iki saat kaynatılır ve 24 saat olduğu gibi bekletilir. Süre sonunda süzülüp, süzüntü içine tekrar saf su konarak 4 lt'ye tamamlanır. İçerisine % 2 oranında agar katılarak, kaynama noktasına kadar ısıtılır. Bundan sonraki işlemler malt-agarda olduğu gibidir.
Ortamlar hazırlandığında, bunlar steril aşılama odasına alınır. Burada bir kişi alev altında petri kabının kapağını veya şişelerin ağzını açar. Diğer kişi steril cam kaplarda bulunan sporlardan, alevden geçirilmiş ok ucu iğne veya bıçakla alarak besin ortamı üzerine eker. sonra ortamların ağızı yine alevden geçirilerek kapatılır. Bu işlemler mümkün olduğu kadar çok çabuk yapılır. İşlem yapılırken konuşmamalı, derin nefes alınmamalıdır. Şayet ağızda maske bulunursa, bu tedbirleri almaya gerek kalmaz Sporların ekilmesinde tekli veya çoklu spor yöntemi uygulanır. Tek bir sporu 2n (diploid) yapıda ve sporları çimlendiği zaman sekonder miseller veren türler, verimli sporlara sahiptir. Bunların sporlarının tek tek ekilmesinde bir sakınca yoktur. Tek spor ekiminden, her spor kendi başına çimlenerek tek bir misel meydana getirir. Bu misel çoğaltılarak saf,hatlar elde olunabilir. Sekonder misellere sahip sporların çoklu halde ekilmesi üretim, tek ekilmesi ıslah amaçlıdır. Sporların çimlenmesiyle primer hifler meydana geliyorsa, bunların verimli hale gelmesi için, iki farklı cinsiyette miselin birleşmesi ve sekonder misel meydana getirmesi gerekir. Bunun için bu türlerde özellikle çoklu spor aşılaması yapılır. Daha sonra sekonder miseller tek tek alınıp, hat oluşumuna gidilir. Normal mantar üretiminde, önemli olan verimli misel elde etmektir. Islahta amaca göre tekli veya çoklu spor yönteminden birisi seçilir.
Misel elde etmede sporlar yanında doku parçalan da kullanılabilir. Anaçlık seçilmiş mantarlar steril aşılama odasına alınır. Üstleri dezenfekte edilir. Sonra mantarın kabuk kısmı kaldırılıp alttaki etli dokudan ufak bir parça alınıp besin eriği üzerine konur. 20-40 gün zarfında bu doku parçası etrafında miseller oluşmaya başlar.
Spor veya doku parçası ekilmiş ortamlar çimlendirme dolaplarına yerleştirilir. Dolap sıcaklığı 20-25"C 'ye ayarlanır. Karanlık koşullarda 20-40 gün içinde sporların çimlenmesiyle oluşan hifler, bölünerek çoğalır ve kabın her tarafını miseller kaplar. Bu hazırlanan ortama "ANA KÜLTÜR" adı verilir (Şekil 8.10).
Ana kültür hazırlanırken bazı önemli sorunlarla karşılaşabiliriz. Cetvel 8.9 'de bu sorunlar ve çözüm yollan verilmiştir.
c. Üçüncü safha (Tohumluk misellerin hazırlanması)
İster spordan, ister dokudan elde edilmiş ana kültür halindeki misellerden alınarak, daha sonra kompost veya bir tohum üzerine aşılanarak ve burada tohumlara sardırarak tohumluk misel elde edilir. Bu ilk elde olunan tohumluk misellerde de, aynı işlem tekrar yapılarak çok daha fazla çoğaltılır ve üreticilere satış için ticari tohumluk meydana getirilir. Tohumluk ve ticari tohumluğunun yapılış yolu aynıdır. Bir şişedeki veya petri kabındaki ana kültürden genel olarak 10 şişe bir litrelik 1. el tohumluk misel; her bir tohumluk şişeden 100-1.000 adet 2. el tohumluk misel; 2. el tohumluğunda çoğaltılmasıyla, ticari tohumluk elde olunacağı düşünülür.
Ticari tohumluğun üretildiği ortamlar oldukça farklılık gösterir. Genelde katı ve sıvı iki guruba ayrılır. Ahır gübresi; at gübresi; kompost; buğday, çavdar, darı, mısır, süpürge otu tohumları; besin maddesi doyrulmuş kepek ve perlit ayrı ayrı ve ikisinin karışımları üzerinde geliştirilmiş misellerden elde edilen tohumluk, katı tohumluğu; sıvı besin ortamlarında geliştirilmiş misellerden elde edilen tohumluk, sıvı tohumluğu (püskürtme yaparak aşılama) meydana getirir (Şekil 8.11 ve 8.12). Bu tohumluklar içinde en fazla kullanılanı buğday, çavdar ve darı üzerine sardırılmış tohumluktur. Bu katı tohumluk, diğer katı tohumluktan ayrılarak ve özel bir isim verilerek dane tohumluk olarak bilinir. Dane tohumluğun, diğer materyaller üzerinde üretilen tohumluğa karşın bazı avantajları vardır. Bir litrede, buğday tohumluğunda yaklaşık 24.000 adet, darıda ise 70.000 adet dane tohum bulunmaktadır. Kompost içine tohumluğun ekilmesinde dane sayısı ne kadar artarsa, aşılanma yüzeyi o kadar fazlalaşacak ve miselin kompostu sarma süresi kısalacaktır. Bu avantajlardan dolayı başlangıç yıllarında fazla kullanılan gübre tohumluğu giderek silinmiştir. Ancak dane tohumluğun da, büyük avantajları yanında bazı dezavantajları bulunmaktadır. Dane tohumluk keneler ve fareler için cazip bir yiyecektir ve mantarhanede barınmalarına olanak teşkil eder. Bir diğer istenmeyen yanı, yeşil küflere çabuk yakalanmalarıdır. Dane tohumluğun bu kötü yanlarından dolayı, günümüzde diğer bazı tohumluk materyal arayışları devam etmektedir. Bunlar perlit gibi toz veya sıvı tohumluklar olup, uygulamada henüz kesin sonuçlar alınmamış ve araştırmalarına şu anda devam edilmektedir. Günümüzün en çok kullanılan dane tohumluğun yapılış şekli, kullanılan tohum türleri
I farklı bile olsa, yapılış sistemi bir birine çok benzer. Bu bakımdan, burada buğday tohumluğu ele alınarak anlatım yapılacaktır.
10 kg buğday bol sıcak su içinde 15-30 dakika kaynatılır. Bu sırada buğday daneleri hafif pişmeli ve su emerek yumuşamalıdır. Ancak taneler fazla şişerek ve su alarak çatlamış, bünyesindeki nişastalı maddelerin suda erimiş salgısı, çatlamış kısımlardan ortam içine çıkmış ve ortama bulaşmış durumda olmamalıdır. Şişelere salgının bulaşması, ilerde şişeler içinde mantari ve bakteriyel hastalıkların çabucak üremesine yol açar. Buğdaylar yumuşayınca elek telleri üzerine dökülüp suyu süzülür ve danelerin yüzeysel kuruması sağlanır. Materyalin fazlalığına ve işi çabuklaştırmaya bağlı olarak, kurutma sırasında gerekirse vantilatör veya aspiratör kullanılır. Böylece tohumların üst yüzeyin kurutulması hızlandırılır.
Kaynatma yerine tohumların su emeceği, şişeceği, yumuşayacağı ve çatlamanın daha az olacağı diğer bir yol, tohumları su içinde 10-30 saat süre ile bekletmedir. Süre sonunda tohumların sudan alınıp süzülmesi ve üst yüzeylerinin kurutulması yapılır.
Üst yüzey kuruduktan sonra, 10 kg buğdaya 50 g kireç, 200 g alçı ilave edilip, çok iyi karıştırılır. Kireç ve alçının bütün danelerin üst yüzeyini kaplamasına özen gösterilir. Bazı araştırma sonuçlarında ortama katılacak kirecin %0,3: alçının % 1,3 olması tavsiye edilir. Kireç ortamı pH'nın 6-6,6' te kalmasını, alçı ise danelerin birbirine yapışmasını önler. Bu bakımdan katılacak kireç ve alçı oranı, esasında ortamın pH durumuna göre hesaplanmalıdır. Materyal, daha sonra 1 veya 5 lt 'ye kadar hacmi olan şişelere, şişe hacminin 2/3 'ne kadar doldurulur. Ağızları özel kapaklarla kapatılarak, kapak yoksa önce pamuk tıkaç sokulup, sonra alimünyum folye ile üzeri güzelce sarılır. Alimünyum folye şişe içindeki nemin kaçmasını önler. Alimünyum folye yoksa, aynı görevi kağıt parçası da yapabilir. Son yıllarda cam şişelerin yerini içi görülebilen sıcağa dayanıklı plastik kaplar veya torbalar almaktadır. Bunlar hafif olduklarından ve fiyatları ucuz bulunduğundan, misel üretim sonrası satışın doğrudan bu kaplar içinde yapılmasından, ayrıca paketlemeye gerek duyulmamasından kullanımları giderek yaygınlaşmaktadır.
Buraya kadar anlatılanlar, misel laboratuvarının ön hazırlık odasında gerçekleştirilir. Bu odada bulunan otoklavın kapağı açılıp, şişeler otoklava konur. Ağzı kapatılır ve otoklav 125-130°C 'de 1,5-2 saat süreyle çalıştırılıp, şişeler içindeki materyal sterilize edilir. Otoklav çalıştırıldığında, sıcaklık artarken meydana gelen basınç, otoklav iç havasının şişmesine neden olur. Şişen havanın dışarı çıkması için, basınç vanası açık tutulur. Sıcaklık 100°C 'ye geldiğinde otoklavda artık basınçlı hava kalmaz ve vana kapatılır. Şişelerin otoklav süresi, şişe büyüklüğüne, içine konan materyalin özelliğine göre ayarlanır. Materyal daha steril olsun diye, uzun süre veya ekonomik olsun diye daha kısa süre tutmak doğru değildir. Sterilizasyon süresi sonunda otoklavın çalışması durdurulur, kendi haline soğumaya bırakılır. Sıcaklık 80°C 'ye geldiğinde otoklavın basınç vanası açılıp içindeki basınç düşürülür. Sonra otoklav sıcaklığı 60°C 'ye geldiğinde, otoklavın aşılama odası tarafındaki kapağı açılır.
Şişeler sıcak sıcak otoklav odası kısmından, misel aşılama odasına götürülür. Burada bulunan tezgahlara konur ve 20-30°C 'ye soğuyuncaya kadar beklenir. Bu sırada aşılama odasının kapıları kapanır ve ultraviole lambalar en az 12 saat yakılır.
Sürekli misel üreten ve aşılama yapan, tohumculuk firmalarında bir kaç otoklav bulunur. Otoklav basınç vanası' açılıp, basınç düşürüldükten sonra kapağı açılıp, otoklav içinden alınan materyal aşılama odasının otoklav kısmına konur. Şişelerin 20-30°C 'ye kadar soğuması beklenir. Sonra şişeler bant yardımı ile aşılama odasına alınır. Sürekli çalışan laboratuvarlarda ultraviole lambalar ancak, işin sona erdiği ve odada kimsenin bulunmadığı gece saatlerinde yakılır.
Şişeler istenen sıcaklık derecesine ulaşınca aşılama yapılır. Önce ultraviole lamba söndürülür. 10-15 dakika beklenir. Bu sırada odaya steril hava basılır. Sonra odaya steril elbise giyilmiş, ağız ve buruna maske takılmış olarak girilir. Aşılama odasına dışardan devamlı taze hava verildiğinden, oda içi basıncı arttığından, oda içindeki hava devamlı dışarı çıkar. Böylece dışardaki kirli havanın içeri sızması önlenir. Odadaki iki kişiden birisi aşılama yapılacak şişelerin ağzını alev üzerinde açar. Diğeri, aşılama kullanılacak ana kültür şişesini veya tohumluk şişesini açar (Şekil 8.13). Ana kültürden aşılama yapılacaksa, bir bıçak yardımı ile besin ortamından bir parçayı alıp, aşılanacak şişe içindeki materyalin üzerine bırakır. Tohumluk materyal kullanılacaksa, bu şişeyi önce sallayarak içindeki materyalin parçalanması sağlanmalı, sonra bir pens yardımı ile 5-10 adet dane alıp, aşılama yapılmalıdır. Aşılama bitince şişelerin ağızları aleve tutularak kapatılır. Şişeler yan tezgah üzerine yığılır. İşleme devam edilerek bütün şişeler aşılanır. Daha sonra aşılanan şişeler hemen misel geliştirme odasına götürülür. Aşılama odası temizlenerek bırakılır.
Misel geliştirme odasında şişeler raflara 15-20 derece meyille konur. Oda içinde 20-25°C sıcaklık ve % 70-80 nem bulunur. 20-30 gün sonunda aşılanmış miseller bütün şişeyi sarar (Şekil 8.14). Sarmayı hızlandırmak için, 6.-7. günden sonra şişeleri 4-5 gün aralıklarla bir veya 2 defa sarsaklamakta yarar vardır. Sıcaklığın biraz yükseltilmesi de çabuk sarmaya olumlu etki yapar.
Tohum üretim laboratuvarında temiz çalışılmaz veya dikkatsizlik sonucu hastalık bulaşması olursa, bu şişelerde penicillium, mucor, fusarium, sarı ve kahverengi küf, virüs, bakteri gibi hastalıklar meydana gelir. Bunların bir kısmı, yeşil, mavi, kırmızı, pembe, kahverengi, siyah gibi değişik renkler, şişe içinde oluşan yapışkan sıvı ile, şişe dışından, diğer bir kısmı şişe açıldığında etrafa yaydığı kokudan çabucak tanınır. Şişeleri sarsaklamanın iyi bir yanı, şişe içinde gelişen, dışardan görülmeyen hastalıkları ortaya çıkarmasıdır. Hastalıklı şişeler hemen üretim odasından alınır. Otoklav edilerek içindeki zararlıların ölmesi sağlanır. Sonra ağızları açılıp şişeler temizlenmeye alınır.
Şekil 8.14. Aşılama Sonrası Misel Gelişmiş 1 kg'lik Tohumluk Şişesi
Sarma işlemi tamamlanan şişeler depoya konur. Satışa veya kullanıma kadar soğuk hava deposunda muhafaza edilir. Tohumluk miseller en fazla 10-15 gün 2-4°C 'de muhafaza edilmelidir. Ticari tohumluk olarak üretimde kullanılacak miseller de bu süre 30-50 güne kadar çıkabilmektedir. Ancak çeşit muhafazası için tohumluğun saklanması, daha önce de belirttiğimiz gibi 0°C 'de uzun yıllar yapılabilmektedir.
Saklama sırasında olduğu kadar, misellerin taşınmaları sırasında da dikkatli davranmak gerekir. Ambalajların çok büyük, sıkışık yapılması, yüksek sıcaklıklarda ve uzun süreli nakledilmesi, kızışmaya ve tohumluk içinde sıcaklığın 30°C üzerine çıkıp, misellerin ölmesine ve en kötü şekliyle aktivitesinin yavaşlamasına neden olabilir.
Kaynak: Mantar Yetiştiriciliği Kitabı Prof. Dr. Atila GÜNAY
King of Spades Casino Review (2021) - Shootercasino.com
YanıtlaSilKing of Spades Casino is one of the 인카지노 most trustworthy casinos on the net. You can enjoy this casino with any device and get 제왕 카지노 your maximum 온카지노